cDNA片段库的高通量测序以及交联免疫扩增(HITS-CLIP和CLIP-seq)
HITS-CLIP 和 CLIP-seq 可以用于定位体内的蛋白质RNA相互作用位点。这个测序技术同RIP-seq类似,但是用交联来固定蛋白质RNA复合物。方法是将RNA蛋白质复合物用紫外线交联并做免疫沉淀。复合物经过RNA酶和蛋白酶K的处理,然后提取RNA,并逆转录成cDNA,测序结果可提供精确到单碱基的蛋白质与RNA结合信息。
技术优点:
- 用交联来固定蛋白质的靶向结合位点
- 紫外线交联可以应用于实验材料体内
- 由于使用RNA酶消化,可以得到低噪声高分辨率的结合位点
- 不需要对所研究的RNA结合信息有先验了解
- 全基因组水平的RNA扫描
技术缺点:
- 没有特异性靶标的抗体可能会结合非特异性的复合物
- 紫外线交联不是非常有效,需要蛋白质和RNA近距离结合,远距离的可能会无法形成复合物
- 交联步骤可能会引入外源污染物