整理一下这几种技术的原理和数据分析流程。

3C

染色质构象捕获（3C）技术是用福尔马林瞬时固定细胞核染色质，用过量的限制性内切酶酶切消化染色质 - 蛋白质交联物，在 DNA 浓度极低而连接酶浓度极高的条件下用连接酶连接消化物，蛋白酶 K 消化交联物以释放出结合的蛋白质，用推测可能有互作的目的片段的引物进行普通PCR和定量PCR来确定是否存在相互作用。3C 技术假定物理上互作的 DNA 片段连接频率最高，以基因座特异性 PCR 来检测基因组中 DNA 片段之间的物理接触，最终以 PCR 产物的丰度来确定是否存在相互作用。注意：用PCR意味着我们对于消化后留下的片段，知道其序列信息。

4C

4C 技术称环状染色质构象捕获 （circular chromosome conformation capture） 或芯片染色质构象捕获（chromosome conformation capture-on-chip），特点就是对于酶切下来的片段进行环化，然后用反向PCR从已知区域开始扩增出环状的部分。然后用芯片进行序列分析。此时做PCR，我们不需要知道序列两端的信息，只需要知道一段的信息。

5C

若研究几百个染色质片段之间可能存在的相互作用，使用3C技术需要设计大量PCR引物来确定已知片段与假定片段的关系，通量较低，较难实现。因此，人们设计出3C碳拷贝（3C-carbon copy，5C）技术，这个技术是基于3C的基本原理，结合连接介导的扩增 （ligation-mediated amplification，LMA）来增加3C检测的通量。以3C酶切连接文库为模板 ，在3C引物端加上通用接头（例如T7、T3），例如在正向引物（bait）的5’端加上T7接头，在反向引物的3’端加上T3接头，若两个推测片段存在相互连接，由于连接酶介导的连接作用的性质，只有连接上的片段才有扩增。 这样，利用通用引物T7、T3进行PCR，而后将产物进行高通量测序即可实现高通量的3C实验。

HiC

是在3C的基础上，在酶切后将缺口进行补平（dCTP 进行生物素标），然后用连接酶进行连接，将样本进行超声破碎，随后用生物素亲和层析将片段沉淀（也就是抓下来带有生物素标记的片段），加上接头进行深度测序。

ChIP-loop

常见的有ChIP-3C和ChIP-4C，在过量的限制性内切酶将染色质 -蛋白质交连物酶切消化后，用所研究蛋白质因子特异性的抗体进行免疫沉淀，然后再进行酶切产物连接，后续步骤同3C、4C相同。注意：使用特异性抗体沉淀下来的蛋白质有可能作用于目的 DNA 旁边的位点，而不是介导目的DNA 与其他 DNA 之间的相互作用。

ChIA-PET

ChIA-PET(chromatin immunoprecipitation using PET) 技术是3C、paired-end-tags (PET)和下一代测序技术的结合，既可检测细胞内染色质的相互作用又可解决实验所得DNA片段较小、数据量大等问题。它可以无偏的、在全基因组范围找出与目标蛋白因子作用的染色质片段。其部分实验流程与ChIP-loop实验相似，都是以福尔马林固定细胞，限制性酶切基因组，用目的蛋白特异性的抗体沉淀蛋白质-DNA 复合物，给酶切片段加上带有生物素标记的接头(此接头带有特殊的酶切位点，例如 Mme I)，然后进行二次连接反应，再使用带有接头的酶进行酶切(例如 Mme I)，所得产物再加上接头，进行深度测序。使用ChIA-PET可确定目标蛋白与DNA作用的位点，也可进一步确定目标蛋白可能调控的基因。带生物素标记可以较准确的定位蛋白质与DNA相互作用区域。研究的是特定蛋白介导的DNA与DNA的相互作用。

具体实验流程看这张图可以一目了然：

HiC （选自：Comprehensive Mapping of Long-Range Interactions Reveals Folding Principles of the Human Genome）

3C，4C，5C （摘自：wiki）

几种方法的比较（选自：A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization）

HiC 数据分析

HiC数据从fastq到bam文件主要经过：truncate, mapping, filter, deduplication这几个步骤。

在mapping的时候要去掉chimeric reads。filter时需要过滤掉一些同cutting site距离较远的reads。

从bam到interaction图像，我测试通过的方法有：

1.hicexplorer

这个方法坑很多，他们的程序里有错，但是没有更新。 主要问题有：1）hicCorrectMatrix 参数同网上教程中的不同。2）画图时只能输出.png图像。3）从github下载安装的软件有引用library错误。

2.HOMER

HOMER功能真全面。用这个工具时要注意makeTagDirectory这个步骤中处理pairend reads要在后面加上-illuminaPE选项，要不然analyzeHiC识别不出Tags。

HiC 生成相互作用矩阵

这是从raw data到关键信息提取的关键步骤。

生成相互作用矩阵要用pairend的mapping到远处的成对Reads，首先对基因组划分区间（bin），然后确定过滤好的成对reads 究竟落在哪两个区间里，然后在矩阵中那两个区间对应的单元中填写reads数量。

填写完所有的矩阵元素，还最好做一个归一化。 方法有很多种：1.假设binA和binB相距50kb，那么将所有（或者sampling很多）50kb的bin的reads数求期望。用binA和binB的reads数除以平均reads数。 2.假设binA有30个相互作用的bin，binB有20个相互作用的bin，binA和binB之间有100条reads，那么归一化位为100/(20*30) （是不是一种平均除？）

参考资料

1. 染色质构象捕获及其衍生技术

上个月最火的话题莫过于AlphaGO同李世乭的围棋比赛。赛前我还以为“李师师”肯定能取得完胜，结果第一盘就让我彻底傻了眼。 整个比赛证明了在人工智能在下围棋领域已经较为完善，人已经下不过程序了。

那段时间还看了王垠的几篇文章批评google搞的AlphaGO没有什么深刻意义，就像IBM的深蓝，火了一阵就没有了消息。 又如同基本废掉的google glass。他还评论了google自动驾驶其实也需要很多研究，现在的完全不可靠。

看完他的文章可以让人冷静下来;)（道理是对的，虽然论据很扯）。对于人工智能，如果连大脑的结构都没搞清楚，把一些统计学习的方法吹的神乎其神，意义不大。如果真的能像人脑一样学习，我们就离脑后插管不远了～～～ [20160621更新]这个人再写文章标题估计就是《关于离开地球的决定》，谁给他回国送钱谁傻子，为了证明我能客观的评价这个人的文章，补充了这么多次更新内容-_-b。

前几年火的3D打印，现在好像也不那么火的集中报道了。大数据吹了一波又一波，早已经吹到生物领域了，就一般生物信息分析人员的水平，是搞不起来的。 最近狂轰乱炸的新闻都是关于是虚拟现实，微软没次都吃螃蟹（上次是比尔盖茨亲自推荐的平板电脑，当时的新闻在我的脑海中挥之不去，我本以为是未来或者根本不会在我们的生活中推广的东西，结果乔布斯把它推广到了普通人的身边），不知道这次结果会不会好一些，不过我很尊敬这家吃螃蟹的公司。

Elon Musk的SpaceX最近成功在海面回收了一个火箭，火箭发射成本越来越低，亚马逊的Jeff Bezos也在做这个，万一哪天向太空进发殖民或者逃难，这些个公司就赚发了。 殖民火星也不是问题，根据现在的技术来开发配套的火星定居点搭建设备，更高级的太阳能续电池。

Musk形容在开发火星是为了防止人类在地球灭绝，在火星上拷贝一套自给自足的人类社会需要100万人口(出自waitbutwhy的采访专稿)。

啰哩啰嗦的写了这些废话，是要认清哪些是玩具哪些是推动社会前进的工具，认清现实。

20160531更新

Google把它收购的机器人公司给转手了，买给了丰田公司，这是由于机器人公司不赚钱，高层之间的理念又不合，所以分道扬镳。所以是不是可以这样说：Google的机器人项目又废掉了。

今天是杨提督的生日。但是我很悲伤的写下这篇关于移动硬盘的故事。 在大学毕业的时候同学组织集体团购的移动硬盘终于被我玩费了，虽然移动硬派买来的时候就不太好用，应该是移动硬盘盒供电不足并且usb接触不良。 由于没有大问题，我当时也没什么数据放到移动硬盘里，这个移动硬盘也算顺利的帮我度过了研究生生涯。 取年由于实在无法忍受硬盘插入电脑无反应的情况，买了个新的硬盘盒，结果用到今年三月份，也无响应了。 一开始就像电脑设备维修中说的一样，先把硬盘拿出来放到电脑里，可以顺利读出所有内容，所以我没在意，也没有及时备份，所有数据都在移动硬盘里，且没有备份！ 结果换了新的硬盘盒（第三个）之后，完全读不出来了。

于是进入抓狂模式，下载了一系列检测软件想读出内容，并曾经想格式化重新分区，重新写入分区表信息，这些努力都失败。 最后花了几百大洋也没让专业人士拯救回数据，主要原因就是之前自己瞎恢复的时候重复读写硬盘，把硬盘划坏了。

然后我开启了扫描实验室电脑硬盘和所有自己的移动介质的工作，也没找回多少内容。

经过这件事情，得到了深刻的教训，已前的工作数据基本报废，只有最后的总结文档还留了下来。

经验教训如下：

1. 不要参加熟人为中介的团购活动，即便买了东西感觉不好用，也碍于面子懒得退回。买东西就要买家卖家一对一。
2. 不要太看重某些电子数据的价值，例如电子书，程序的中间输出文件，这些内容能删就删。存了那么多电子书，都够看上一二十年的了，完全没必要。
3. 要备份，要备份，要备份……
4. 很多数据可以压缩处理，另外要经常整理数据结果，确定好哪些是必须留下的。
5. 能做网盘同步就同步到云端，推荐google的15G，微软的只有5G，用国内的要小心国家政策影响，完一哪天都没了，都没地方去告。这些只是用于同步资料，图片影音最好还是存在本地，重要的图片要打包上传。
6. 写程序要有后缀，我之前写脚本程序都不加后缀，结果发现在恢复时，很多恢复软件只识别有后缀的那些文件，没有后缀的都放到temp里，我得一个一个打开挑出来。

所用的软件：

• R-studio：可以读取损坏硬盘并制作镜像，较为专业的恢复软件
• EasyRecovery：只能恢复普通删除的文件，不能使用在损坏的硬盘上
• TestDisk：无法对损坏的硬盘做分区操作
• photorec：恢复普通删除文件，不能使用在损坏的硬盘上。

生活小窍门-_-b，终于我也沦落到要写这种内容的时候了。

最近移动硬盘一直不太配合，今天彻底无法链接到电脑，测试了多次，最终定位是移动硬盘盒的问题（SSK的，用了不到一年）。 记录一下相关的操作方法。

电脑无法链接移动硬盘（设备描述符请求失败）

测试：如果在链接电脑时会听见滴滴的声音，说明是供电有问题。 步骤1：在上述条件下，若电脑无法显示链接，请拔掉连线重新链接，并测试设备管理器里的usb驱动是否有问题，停止使用并重新扫描。 步骤2：若还无法解决且移动硬盘是2.5寸的，可以将其换到笔记本电脑上，查看是否可以正常使用。若是3.5寸的，需要连接台式机进行测试。 上述测试若硬盘可以在电脑里正常读取，则说明问题出在移动硬盘盒上。（此时可以将重要的数据拷到U盘里备份） 结论：需要购买新的移动硬盘盒。

还没修好！快要沦落到开盘了！ 20160330

固态硬盘选购

现在的新笔记本都有专门的固态硬盘MSATA接口，不需要旧的像2.5寸盘大小的SATA3固态硬盘了，买MSATA固态硬盘。 占用空间比内存条还小。

系统

赶紧升级到windows10吧，比7和8强了不止一点。

屏幕

如果笔记本屏幕坏了，什么方法能最快的将数据导出？ 一般学校都会有投影仪，将笔记本接到投影仪上，打开投影仪当作屏幕。 之后请找笔记本售后服务商进行换屏（普通笔记本一般屏幕200左右，人工费用也就几十元，经同学杨老板亲测）。

买什么笔记本好？

对于做计算，写代码，绘图为主的用户，有钱请上水果，没钱请上船。

十年河东，十年河西，10年前完全不会考虑的品牌（神舟），现在已经很良心了（但品控不好，靠人品）。

我觉得笔记本没必要买外星人，有那么多钱还不如配个台式机，那么沉的外星人，即便买了也不会天天背着跑。

思前想后，还是开了这个目录，要不有些东西写了就归类不能了。

今天谈一下ChIP-seq流程以及数据control的问题。ChIP是染色质免疫共沉淀，基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP-seq的流程中一定要有去除deplication的步骤，虽然网上讨论中大家总是谨慎的回答it depends on…blablabla…。

ChIP中一般会用到对照数据，对照数据就是在不特意富集所研究的蛋白结合的DNA片段情况下，有多少DNA片段可以纯化并检验出来。

一般有两种对照，一种是Mock IP（看看在不用抗体的情况下有哪些蛋白会和DNA结合），另一种是直接检测input DNA。在最后¹列出了一个非常好的ChIP教学文档，里面介绍了抓IgG和input DNA究竟是怎么一回事。

首先说input DNA：这是通过整套流程，但没有用抗体去筛选DNA片段时，最后会被纯化下来的DNA片段，即：这些片段不代表同转录因子相结合的区域。 接下来是Mock IP：这是通过类似的ChIP处理，但不抓想研究的蛋白时，纯化出的一些同蛋白相结合的DNA片段。

一般情况下优先选择Input DNA方法，第二种方法有正义（究竟这么抓到的DNA能否做对照？我对此持怀疑态度）。

另外，Treatment和control的处理也需要关注，在call peaks的时候要选择会用Control做校正的方法。 如果是自己处理，查找Treatment的分布信息，也要做校正，否则就像我之间讨论过的某篇文章一样。

参考资料