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前一段时间有幸聆听了杨晓飞做的关于DNA甲基化相关的报告，现在简要回顾一下他们这篇文章的内容。另外这个工作的参与者里还有Xiaojian Shao老师，不过他挂名的工作单位实在是太奇怪了_-_。另外这篇文章是收费的，所有Supplementary无法下载-_-'

Systematic DNA methylation analysis of multiple cell lines reveals common and specific patterns within and across tissues of origin

这个工作主要是用定义并设计了一个方法找出DNA甲基化相关位置（local clusters of CpG sites），并在获得的DNA甲基化区段内进行多组织间的分析。

整个工作分为三个层次：

• 找寻DNA甲基化在各个组织间的common pattern
  • 在基因组上的富集情况
  • 功能
  • 同（基因）表达的相关性
• 细胞谱系特异性的pattern
  • 甲基化pattern
  • 在基因组上的富集情况
  • motif的富集情况
• 细胞系特异性的pattern
  • 甲基化pattern
  • 功能的富集
  • 同（基因）表达的相关性

1.local clusters of CpG sites（LCCS）的找寻方法

本文采用的ENCODE项目reduced representation bisulfite sequencing (RRBS)的甲基化数据，一共用了54正常细胞系。

根据我自己对数据的理解，由于RRBS数据只是在一些位点测定了DNA的甲基化情况，而不是全基因组测定DNA甲基化情况，所以位点比较稀疏。

local clusters of CpG sites的就是把DNA甲基化位点密集的区域变成一个unit，对DNA甲基化位点进行聚类。具体的聚类方法如下（意思差不多，这个是我听讲座后自己总结的）：

1. 找到在整个基因组上距离最近的两个甲基化位点，将这两个点归为一个unit
2. 从这两个点的上下游找寻距离这个unit最近的一个甲基化位点，把这第三个甲基化位点放入unit里
3. 重复第二个步骤，直到这个unit的长度达到500bp(不超过500bp)，这样就选出了一个LCCS
4. 接下来再次进行第一到第三步骤，直至所有的甲基化位点都成为某个LCCS的一部分

最终在所有用于研究的细胞系中，他们找到了35276个LCCSs，LCCSs的长度中位数是79bp，每个LCCS上有7个CpG。对于大多数LCCSs（21417，60.7%）甲基化比例(percent methylated value，简称为PM)的方差小于5。

2.加权LCCS共甲基化网络的分析展示出不同生物（过程）相关的共甲基化模块

下面所有分析中没有对DNA甲基化数据做样本间的normalization，当时演讲人说ENCODE网站上有信息说这些数据可以相互比较。

本文中将LCCSs进行聚类，发现了7个group(module 模块)，这7个模块中5个是高甲基化的，2个是低甲基化的。高甲基化的区域多在非编码，基因体，open sea¹，低甲基化的区域多为启动子， CpG islands（CGI）在open sea区域很少见。接下来，就是对高甲基化和低甲基化区域(各个模块)的分析（关于功能，以及同基因表达的相关性），没有什么有意思的发现，就不赘述了。

在什么地方用到了网络？ 为了度量不同细胞系之间的LCCS是否相似，文中采用加权LCCS共甲基化网络，找出细胞系之间相似的甲基化LCCS模块。

3.细胞谱系特异性的pattern分析

首先对LCCSs根据细胞谱系进行聚类（血液、肝脏、肺、心脏等），发现细胞谱系特异性的DNA甲基化多富集在基因体 和非CpG岛区域。之后就找了在低甲基化的LCCSs区域内的motif，发现了一些同转录调控相关的蛋白motif。最后找到了同细胞谱系特异性的LCCSs相关的一些基因，这些基因根据资料也的确是细胞谱系特异性表达。

4.细胞系特异性的pattern

本文中发现细胞特异性的LCCSs富集在不同的染色质状态（chromatin states），细胞系特异性的高甲基化LCCSs在weak transcriptional state富集，低甲基化的LCCSs富集在活跃的启动子和增强子区域。

分析软件

• WGCNA package
• HOMER

单词本

附注

Single cell RNA seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells

Nature Structural & Molecular Biology 20, 1131–1139 (2013) doi:10.1038/nsmb.2660

Received 18 July 2013 Accepted 05 August 2013 Published online 11 August 2013

http://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n9/full/nsmb.2660.html

本文一共对胚胎以及胚胎干细胞系阶段的124个单细胞进行测序。分析了RNA表达情况，是关于单细胞RNA方面的一篇早期研究文章。

主要研究结论

1.不同细胞类型间的转录情况分析

本文研究的细胞类型包括卵母细胞，受精卵，2细胞卵裂球，4细胞卵裂球，8细胞卵裂球，桑椹胚，晚期囊胚，hESC细胞，传代10代后的hESC细胞。所有细胞经过了严格的形态学筛选。以往研究中已经确认在4细胞和8细胞阶段基因的表达情况会有极大的改变，该阶段是Maternal to zygotic transition (MZT) 期。 本文在单细胞中测得属于RefSeq基因列表里的11006个基因(占所有RefSeq基因的49%)以及RefSeq转录本列表中18002个转录本（占总体的48%）。对于受精卵胚胎细胞的表达水平（RPKM>0.1）进行了聚类分析以及主成份分析，分析发现8细胞阶段和桑椹胚阶段的的表达水平有些类似。在人类中MZT阶段主要是在8细胞时期，文中找到了2495个显著上调的基因（zygotic gene activation）,上调基因的功能多富集在RNA新陈代谢，RNA剪接，核糖核蛋白复合物的生成，核糖体的产生中。

2.可变剪接的动态模式

文中分析的基因里有4822个基因至少产生了2个转录本。根据转录本特异性的外显子连接区域（junction）序列的唯一比对(uniquely mapping)，有20%（总数4822）的基因产生了2个以上的转录本，最高达到7个转录本。在所研究的7个发育阶段中（卵母细胞，受精卵，2细胞卵裂球，4细胞卵裂球，8细胞卵裂球，桑椹胚，晚期囊胚）只有206个基因在每个阶段都有多转录本的表达，其他的基因的多转录本只在特定的几个阶段中能检测到。另外，至少66%的情况下，基因所表达的主要异构体（major isoform）别其他的异构体表达量高2倍。另外文中以forkhead box(FOX) transcriptional factor, FOXP1为例子，说明了一个ESC阶段特异性转录本异构体有一个外显子（exon 18b），这个异构体编码出的蛋白质与维持细胞多功能性相关，在体外胚胎干细胞中检测到的exon 18b是exon 18a的25倍。但是这幅图上（见下方），还展示了一个非特异性表达的外显子exon 19，图中可以看到这个外显子在PE(原始内胚层)时期没有表达量数据，这个究竟是为什么，文中没有给出解释。

3.长非编码RNA(lncRNA)的表达情况

如果把所有的数据（124个细胞？）整合在一起分析，lncRNA的转录本拷贝数量均值是蛋白编码基因的十分之一（10%），同前人的数据结果较为一致。但是，如果对于每个单细胞进行分析，lncRNA的拷贝数量均值可以达到蛋白编码基因的40.5%。文章中只有在这里用到了拷贝数量(copy number)这个词组，我不知道这个是指普通意义上的DNA上的gene copy number还是表达量水平。

4.未知的蛋白编码转录本以及lncRNA

为了找寻未知的新转录本，文中，首先排除了在已知基因上下游10kb范围内找到的未知转录本，并认为这些潜在的未知转录本可能是已知基因的一部分。接下来，对在排除后的区域内找到的新转录本进行了分析，从转录本长度，保守性方面说明文中所找到的新转录本同已知的转录本很相似，并且也看到了一些转录本在7个发育阶段的表达水平有很大的差异，说明这些新找出的转录本参与到了胚胎的发育调控中。

5.hESCs和外胚层细胞的异同点（tracing pluripotency during the derivation of hESCs）

hESCs是从囊胚内团细胞（inner cell mass）的外胚层中分化来的，但是关于hESCs同外胚层细胞的异同点的全面分析却很少。本文分析了晚期囊胚阶段的30个细胞（分别属于桑椹胚滋养外胚层(mural TE)，极滋养外胚层细胞(polar TE)，外胚层以及原始内胚层），对已知RefSeq基因的表达情况进行聚类分析（在聚类中用到了bootstrap）。并对一些marker基因在外胚层、滋养外胚层、原始内胚层中的相对表达情况做了分析。之后又对hESCs细胞以及EPI细胞中的上下调的多功能性marker基因进行了分析，分析结果既有一致性，又有区别。说明hESCs细胞与EPI细胞的基因表达有区别。这种区别不仅体现在已知的基因中，对于文章找到的新转录本和lncRNA也存在着类似的区别。最后他们还分析了hESCs同小鼠胚胎干细胞之间的关系（mEpiSCs），分析发现hESCs同mEpiSCs比较类似，mEpiSC特异性的marker基因在hESCs中高表达，但是mESC特异性的marker基因表达量不高。

分析软件

• clValid package (SOTA function)
• Coding Potential Calculator (求保守性水平 \(\omega\) metric)
• pvclust package
• Cufflinks
• Trinity (de novo transcriptome reconstruction)
• PASA (eukaryotic genome annotation tool)
• Cluster (gene expression pattern)
• JavaTreeview (gene expression pattern)

单词本

入夏后，由于笔记本电脑太老，散热性能差，每次开机10分钟后就热得支撑不住，经常罢工，所有project更新减缓。

Authorea是个挺有意思的网站，目的是为了让科学家更好的协同写作，支持GIT/IPYTHON，写作方式支持LATEX/Markdown。感觉有点像Github。注册后可以免费建立无数篇公开文档，和1篇私有文档。需要更多的私有文档，需要购买收费服务。文档还支持导出成pdf, word（rtf）, LaTeX等多种格式。在网页文章中有批注功能，这让协同写作越来越方便了。

那么现在问题来了，有多少人的协同写作文档是可以在写作时就公开的？其实推广还是有一些问题存在的。

持续关注中，貌似用这个来合作记录课堂笔记比较好。