活性mRNA翻译测序 (ART-seq),也被称作核糖体分析,它是分离正在由核糖体加工的RNA,以便监测翻译过程。 该方法首先将与核糖体绑定的RNA进行消化(digestion),然后提取RNA,去掉rRNA,将提取的RNA逆转录成cDNA,最后测序。 测序结果展示了同核糖体绑定的RNA序列正在经历翻译过程。 这种方法已经被改进,以提高结果的质量和数量性质。 应注意以下几点:(1)产生细胞提取物,其中核糖体被正确的终止在它们正在翻译的mRNA上; (2)未被核糖体保护的RNA将被核酸酶消化,然后只回收核糖体保护的mRNA片段; (3)将受保护的RNA片段定量转化成可通过深度测序分析的DNA文库。 加入harringtonine(一种抑制蛋白质生物合成的生物碱)会使核糖体在起始密码子上精确地积累并有助于其检测。

ART-seq

技术优点:

  1. 展示了核糖体在RNA上的精确位置的快照
  2. 核糖体分析比mRNA水平更接近地反映了蛋白质合成的比例
  3. 不需要关于RNA和ORF的先验知识
  4. 这是在全基因组水平的分析
  5. 可以用来确定蛋白质转录区域

技术缺点:

  1. 单一转录本有多个翻译起始位点的情况下,很难确定所有的ORF
  2. 不能测量翻译延伸的动力学数据(速率之类的)