A comparison of fold-change and the t-statistic for microarray data analysis，这文章是大神Robert Tibshirani和Daniela M. Witten（是Robert的一个学生，现在华盛顿大学生统专业做PI）写的。整篇文章每句话都非常重要！

对于芯片数据中control和treatment样本间信号强度的比较，筛选差异大的基因，会用到fold-change或者t-statisitic。 文章作者比较了这两种情况的计算出的差异基因之间的差别。 说明在没有背景噪声的情况下用fc比较好，在有背景噪声的情况下用modified t-statisitic比较好。 作者还指出可重复性同精确性之间也不是完全一致。 传统的t检验在可重复性和精确性上都不如fold-change和改良的t检验，所以在芯片数据分析时，不要用传统的t检验。

Introduction

这部分，文章重点介绍了他们的实验方法，用真实的microarry数据和模拟的数据来做分析，采用的筛选基因的方法包括传统t检验，改良的t检验，两种fold-change方法。 模拟后结果说明用究竟是用fold-change或者改良的t检验取决于我们的研究是对基因表达量的绝对变化感兴趣还是对基因表达量相对于其噪声的变化感兴趣。

Therefore, a researcher’s decision to use fold-change or a modified t-statistic should be based on biological, rather than statistical, considerations.

Statistical measures of differential expression

方法1. 传统t检验的统计量

其中\(s_i\)是对于基因i的组内样本重复间的标准差。

方法2. 改良的t统计量

其中\(s_0\)是为了让\(T^{"}_{i}\)的变异系数最小的一个常量，在本文中用的是Significance Analysis of Microarrays (Tusher et al. 2001)中的计算方法。 我在wiki¹上查了一下，上面说\(s_0\)是根据\(\alpha\)分位数来定的。另外有些文章²中直接将\(s_0\)定义成\(s_i\)的中位数。

方法3. 标准fold-change

其中\(\bar{x^{'}_{ij}}\)和\(\bar{y^{'}_{ij}}\)是基因i在组内样本j的原始表达量（control除以treatment）。

方法4. 另一种fold-change算法

其中我们标记方法3的fold-change为\(FC_{ratio}\)，方法4中的为\(FC_{difference}\)。

另外，我们可以看出在增加\(s_0\)的大小后，方法2的排序结果会逼近方法4的排序结果。 \($s_0\)这个常数越大，t统计量的分母越一致，那么对基因排序起到关键作用的就是分子，分子又通方法4的一样…..所以方法2和方法4的结果会比较一致。

为了证明高度可重复的统计量并不是十分准确的，他们在文中构建了一个人工统计量：

P代表power，文中说不建议在实际中使用这个人工统计量。

Overview of the genes selected using the different measures

文中分别用模拟的数据，按上面的4个方法来计算差异基因。

从下图中可以看出，按普通的t统计量挑选的基因的标准差都很小， fold-change方法找到的基因在control和treatment里有很大的差异， 改良后的t统计量找到的基因有较小的标准差和组间较大的差异。 由于普通的t统计量和fold-change的结果完全不一样，对于研究者来说，要考虑某个基因在研究中是否重要的根据是表达量的偏移还是标准差的偏移。

Simulated and real data Concordance

这节主要介绍了他们用的两种模拟策略：一种是基于正态分布的偏移，另一种是基于样本分组间均值和方差的偏移。

关于一致(Concordance)的定义：在一个基因（挑选后的）集合中的基因也在另一个基因集合中的比例。

Analysis of the accuracy of the different measures

下图就是他们分析的一个结果，可以看到样本量在红线左侧时，用\(FC_{difference}\)比较好，样本量很大时就用改良的t统计量较好。

其实从我们用的方法来寻找差异基因，一共就度量两类差异： 第一类是\(\mid \mu_{control} - \mu_{treatment} \mid\) ，另一类是\(\mid \frac{\mu_{control} - \mu_{treatment}}{\sigma}\mid\)。 后者主要是标准化基因间的噪声（方差），因为基因均值之间的差异可能是源于基因间表达量的方差有差异。

接下来，他们又考虑了一个比较极端的例子。

这个例子中Gene1表达量在两组间差异很大，Gene2表达量在两组间差异很小。但是如果用t统计量来衡量的话，Gene2远大于Gene1。

我自己计算的结果同论文上的不太一样，Gene1的t统计量是3.6844，而不是1.69。

t.test(c(101.1,101.2,101.3),c(100.1,100.2,100.3))

  Welch Two Sample t-test

  data:  c(101.1, 101.2, 101.3) and c(100.1, 100.2, 100.3)
  t = 12.247, df = 4, p-value = 0.0002552
  alternative hypothesis: true difference in means is not equal to 0
  95 percent confidence interval:
  0.7733042 1.2266958
  sample estimates:
  mean of x mean of y 
  101.2     100.2 

t.test(c(150,200,250),c(1,50,100))

  Welch Two Sample t-test

  data:  c(150, 200, 250) and c(1, 50, 100)
  t = 3.6844, df = 3.9996, p-value = 0.02113
  alternative hypothesis: true difference in means is not equal to 0
  95 percent confidence interval:
  36.87866 262.45467
  sample estimates:
  mean of x mean of y 
  200.00000  50.33333 

那么在生物学家的眼中，究竟哪个基因是需要关注的基因呢？我觉得应该是Gene1吧。

From this perspective, the question of whether the fold-changes or a modified t-statistic results in more accurate gene orderings is really a biological one, rather than a statistical one, as it depends on what types of expression differences between control and treatment have biological relevance.

Analysis of the reproducibility of the different measures

接下来他们又检测了各种方法的可重复性。 从下面的两张图中可以看出前面自己定义的P统计量有很好的重复性（下面第一个图），但是没有很好的精确性（下面第二个图）。 因而说明了，重复性和精确性在某些检验指标中不可间得的问题。

Conclusions

1. \(FC_{difference}\)和改良的t检验都是t检验的一种改良形式，也就是有不同的\(s_0\)。一些\(s_0\)的选取可以提高精确性。
2. 别用普通的t检验。
3. 可重复性高并不暗示着精确性高，The issues of reproducibility and accuracy should be kept separate when evaluating the performance of a statistic.
4. 在实际分析中并没有FC和t统计量谁好谁坏的说法，都要看生物学意义。有噪声干扰就用改良的t检验，没有噪声干扰就用FC。

参考资料